PCR

**Princípio:** a PCR produz de milhões a bilhões de cópias de um segmento-alvo de DNA a partir de uma amostra inicial minúscula. A amplificação é exponencial: cerca de 2^n cópias após n ciclos.

**Componentes:** - DNA molde (a amostra) - Dois primers, forward e reverse, complementares às sequências que flanqueiam o alvo - DNA polimerase termoestável (Taq polimerase, de *Thermus aquaticus*), que sobrevive às temperaturas de desnaturação - Desoxinucleotídeos trifosfatados (dNTPs) - Tampão com Mg2+

**Etapas do ciclo (repetidas cerca de 25-40 vezes):** 1. **Desnaturação (~94-95°C):** o calor separa o dsDNA (DNA de fita dupla) em fitas simples. 2. **Anelamento (~50-65°C):** os primers se ligam às sequências complementares em cada fita. 3. **Extensão/alongamento (~72°C):** a Taq polimerase sintetiza novo DNA no sentido 5'→3' a partir dos primers.

**Principais variantes:** - **RT-PCR (PCR com transcriptase reversa):** a transcriptase reversa primeiro converte o RNA em cDNA, que depois é amplificado. É usada para vírus de RNA (HIV, HCV, SARS-CoV-2, influenza). Não confundir com a sigla de "tempo real" (real-time). - **PCR quantitativa/em tempo real (qPCR):** a fluorescência é monitorada a cada ciclo, de modo que a quantidade de produto reflete o molde inicial. É usada para carga viral (HIV, HBV, HCV, CMV, EBV) e expressão gênica. Um Ct (cycle threshold) menor significa mais molde inicial. - **PCR multiplex:** vários conjuntos de primers são usados em uma só reação para detectar múltiplos alvos, como painéis de patógenos respiratórios ou gastrointestinais. - **PCR nested:** uma segunda rodada com primers internos melhora a especificidade.

**Usos clínicos (alto rendimento):** - **Doenças infecciosas:** - Encefalite por HSV: a PCR do HSV no LCR é o exame diagnóstico de escolha. - Mycobacterium tuberculosis: o NAAT rápido (p. ex., Xpert MTB/RIF) também detecta resistência à rifampicina (*rpoB*). - Clamídia/gonorreia: NAAT em urina ou swab. - HIV: diagnóstico em lactentes de mães HIV+ (os anticorpos são IgG maternos), infecção aguda/período de janela e monitoramento da carga viral. - SARS-CoV-2, CMV, vírus JC (LEMP) e muitos outros. - **Genética:** detecta mutações específicas como CFTR ΔF508, fator V de Leiden e expansões de repetições de trinucleotídeos (Huntington, X frágil). Também é usada no diagnóstico pré-natal. - **Oncologia:** detecta translocações como BCR-ABL (LMC, t(9;22)) e PML-RARA (LPA, t(15;17)), e monitora a doença residual mínima. - **Forense/paternidade:** amplifica repetições curtas em tandem (STRs) e VNTRs.

**Limitações/armadilhas:** - Exige sequências flanqueadoras conhecidas para desenhar os primers. - É altamente sensível, de modo que a contaminação causa falsos positivos. - Detecta ácido nucleico, não necessariamente organismos viáveis, de modo que um resultado positivo pode refletir material genético residual ou não viável. - Inibidores na amostra (p. ex., heme) podem causar falsos negativos. - A Taq não tem revisão (proofreading; sem atividade de exonuclease 3'→5'), então podem ocorrer erros. Polimerases de alta fidelidade, como a Pfu, fazem revisão.

**Comparação com outras técnicas moleculares (frequentemente cobradas):** - **Southern blot:** detecção de DNA com sonda de DNA marcada. - **Northern blot:** detecção de RNA. - **Western blot:** detecção de proteínas com anticorpos. - **ELISA:** detecta antígeno ou anticorpo. - **Microarray/FISH:** detectam expressão ou alterações genômicas, ou localizam sequências. - **Sequenciamento de Sanger:** usa didesoxinucleotídeos (ddNTPs) como terminadores de cadeia.

**Observação sobre o nome:** "PCR" também aparece em outros contextos. Exemplos são a *relação proteína:creatinina* (na urina, para proteinúria) e a *proteína C reativa* (frequentemente escrita CRP em inglês ou "PCR" em espanhol/português). No USMLE, PCR quase sempre significa reação em cadeia da polimerase.

**Mnemônico para as etapas do ciclo:** "Denature, Anneal, Extend" [desnaturar, anelar, estender] (calor-frio-morno: 95 → ~55 → 72°C).