Western blot

O Western blot (immunoblotting) envolve várias etapas: (1) extração e desnaturação das proteínas, (2) separação por eletroforese em gel SDS-PAGE com base no peso molecular, (3) transferência ("blotting") das proteínas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF, (4) bloqueio dos sítios de ligação inespecíficos, (5) incubação com um anticorpo primário específico para a proteína-alvo e (6) detecção por meio de um anticorpo secundário marcado (ligado a enzima ou fluorescente) que produz uma banda visível. A presença e a posição das bandas indicam a identidade e a abundância relativa da proteína.

Na prática clínica, o Western blot tem sido classicamente usado como teste confirmatório após uma triagem positiva por ELISA/EIA para anticorpos anti-HIV, pois o ELISA tem alta sensibilidade, enquanto o Western blot oferece maior especificidade ao detectar anticorpos contra proteínas virais específicas (p. ex., gp41, gp120, p24). No entanto, os algoritmos de testagem para HIV atualmente recomendados pelo CDC usam um imunoensaio combinado de antígeno/anticorpo de quarta geração, seguido de um imunoensaio de diferenciação de anticorpos HIV-1/2, em vez do Western blot, devido ao menor tempo de resposta e à melhor detecção durante a janela de infecção aguda.

O Western blot também é usado no diagnóstico de outras condições, como a doença de Lyme (como teste confirmatório em duas etapas após ELISA positivo), e em diversos contextos de pesquisa para estudar a expressão de proteínas, modificações pós-traducionais e validar a especificidade de anticorpos.

Associações de alto rendimento: ELISA (triagem, alta sensibilidade) → Western blot (confirmatório, alta especificidade) é um paradigma clássico de testagem cobrado em provas, particularmente no diagnóstico de HIV e doença de Lyme. Entender o equilíbrio entre sensibilidade e especificidade em estratégias de testagem sequencial é um conceito-chave.