Northern blot

PROCEDIMENTO: (1) Extrair RNA total ou mRNA de tecido/células. (2) Separar o RNA por tamanho por eletroforese em gel de agarose desnaturante (formaldeído ou desnaturante semelhante para evitar estrutura secundária). (3) Transferir (blot) o RNA do gel para uma membrana de náilon ou nitrocelulose por capilaridade. (4) Hibridizar a membrana com uma sonda complementar de DNA ou RNA marcada (radioativa ou quimioluminescente). (5) Lavar e visualizar por autorradiografia ou por imagem. Surge uma banda onde o RNA-alvo está presente; a intensidade da banda reflete o nível de expressão, e a posição da banda reflete o tamanho do transcrito.

O QUE ELE INFORMA: Se um gene é transcrito em um tecido, o nível relativo de expressão, o tamanho do transcrito e o splicing alternativo (múltiplas bandas/tamanhos diferentes). Genes constitutivos (housekeeping) (p. ex., GAPDH, β-actina) servem como controles de carga.

COMPARAÇÃO ENTRE OS BLOTS (alto rendimento): - Southern blot: DNA (detecta presença de genes, deleções, rearranjos, número de cópias; p. ex., repetições CGG do X frágil, polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição). Nome em homenagem a Edwin Southern. - Northern blot: RNA (expressão gênica). - Western blot: Proteína, usando anticorpos marcados (p. ex., teste confirmatório de HIV historicamente, confirmação de doença de Lyme, detecção de príons). - Southwestern blot: proteínas que se ligam ao DNA (detecta a ligação de proteínas ao DNA, p. ex., fatores de transcrição). - Eastern blot: modificações pós-traducionais de proteínas (menos cobrado). Mnemônico: SNoW DRoP: Southern–DNA, Northern–RNA, Western–Protein [proteína].

IMPORTÂNCIA CLÍNICA/PARA AS PROVAS: Usado em pesquisa para quantificar a expressão gênica; amplamente substituído na prática por RT-PCR/qPCR e RNA-seq, que são mais sensíveis, mais rápidos e exigem menos RNA. Vantagens remanescentes: fornece informações sobre o tamanho do transcrito e variantes de splicing e é relativamente simples de interpretar. Técnicas relacionadas comumente cobradas junto: PCR, microarray (hibridização de cDNA a sondas para medir a expressão de muitos genes), ELISA (detecção de proteínas baseada em anticorpos), FISH (hibridização de sonda fluorescente a cromossomos in situ) e RT-PCR (RNA em cDNA pela transcriptase reversa, seguida de amplificação).

PONTO-CHAVE: O nome "Northern" é um trocadilho com Southern blot (não é o nome de uma pessoa); o Southern blot é o único com nome de uma pessoa.