Southern blot

**Etapas (mnemônico SNoW DRoP: Southern = DNA, Northern = RNA, Western = Proteína):** 1. Isolar o DNA da amostra (sangue, tecido). 2. Digerir com endonucleases de restrição para produzir fragmentos. 3. Separar os fragmentos por tamanho por eletroforese em gel de agarose (fragmentos menores migram mais em direção ao ânodo/polo positivo, porque o DNA tem carga negativa). 4. Desnaturar o DNA (tratamento alcalino) para torná-lo de fita simples. 5. Transferir (blot) para uma membrana de nitrocelulose ou náilon por ação capilar. 6. Hibridizar com uma sonda de DNA de fita simples marcada (radioativa ou fluorescente), complementar à sequência-alvo. 7. Lavar a sonda não ligada e visualizar (autorradiografia ou fluorescência). As bandas aparecem apenas onde a sonda se liga à sequência complementar.

**Usos clínicos:** - Detecção de grandes deleções, inserções e rearranjos gênicos (p. ex., rearranjos dos genes dos receptores de células B e T/imunoglobulinas para avaliar clonalidade em neoplasias linfoides). - Diagnóstico de doenças de expansão de repetições de trinucleotídeos, especialmente a síndrome do X frágil (repetições CGG em FMR1). O estado de metilação também pode ser avaliado com enzimas de restrição sensíveis à metilação. A PCR é usada primeiro para expansões menores, enquanto o Southern blot é útil para expansões muito grandes. - Análise de RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição) para impressão digital de DNA, teste de paternidade e análise de ligação. - Detecção de amplificação gênica e variantes estruturais (p. ex., historicamente para o rearranjo BCR-ABL e para a doença falciforme antes dos métodos de PCR). - Confirmação da integração de transgenes em pesquisa.

**Comparação dos blots:** - Southern: amostra de DNA, sonda de DNA. - Northern: amostra de RNA (expressão gênica), sonda de DNA ou RNA. - Western: amostra de proteína, sonda de anticorpo marcado (p. ex., confirmação de HIV, historicamente). - Southwestern: proteínas de ligação ao DNA (p. ex., fatores de transcrição), detectadas com sonda de DNA marcada.

**Pontos-chave para as provas:** - Recebe o nome de Edwin Southern (os demais foram nomeados por jogo de palavras com o nome dele, portanto não homenageiam pessoas). - Exige conhecimento prévio da sequência-alvo para o desenho da sonda. - Detecta a presença, o tamanho e o número de cópias de um fragmento de DNA, não sua expressão. - Técnicas relacionadas: PCR (amplifica o DNA), FISH (localiza sequências nos cromossomos), microarray e sequenciamento de nova geração, que substituíram em grande parte o Southern blot em muitos contextos diagnósticos.